淋巴細(xì)胞雜交瘤單克隆抗體技術(shù) 液氮罐

1975年，Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的雜交細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破不僅為醫(yī)學(xué)與生物學(xué)基礎(chǔ)研究開創(chuàng)了新紀(jì)元，也為臨床疾病的診、防、治提供了新的工具。

制備單克隆抗體包括動物免疫、細(xì)胞融合、選擇雜交瘤、檢測抗體、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)，要經(jīng)過幾個月的一系列實驗步驟，下面按照制備單克隆抗體的流程順序，逐一介紹其實驗方法。

一、細(xì)胞融合前準(zhǔn)備

(一) 免疫方案

選擇合適的免疫方案對于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般要在融合前兩個月左右確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。

1. 顆粒性抗原免疫性較強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細(xì)胞性抗原為例的免疫方案:

初次免疫 1×107/0.5ml ip (腹腔內(nèi)注射)

↓ 2～3周后

第二次免疫 1×107/0.5ml ip

↓ 3周后

加強(qiáng)免疫(融合前三天) 1×107/0.5ml ip或iv(靜脈內(nèi)注射)

↓

取脾融合

2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏*佐劑，福氏不*佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴(kuò)散呈小滴狀表明已達(dá)到油包水的狀態(tài)。商品化福氏*佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻。

初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏*佐劑皮下多點注射

│ (一般0.8～1ml 0.2ml/點)

↓3周后

第二次免疫 劑量同上，加福氏不*佐劑皮下或ip

│ (ip劑量不宜超過0.5ml)

↓3周后

第三次免疫 劑量同上，不加佐劑，ip

│ (5～7天后采血測其效價，檢測免疫效果)

↓2～3周后

加強(qiáng)免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv

↓3天后

取脾融合

目前，用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更新，如①將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷?，一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，促進(jìn)免疫細(xì)胞對抗原反應(yīng)性。液氮罐

(二) 飼養(yǎng)細(xì)胞

在制備單克隆抗體過程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如：在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(較為常用)、小鼠脾臟細(xì)胞或小鼠胸腺細(xì)胞，也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞，使用比較方便，照射后可放入液氮罐長期保存，隨用隨復(fù)蘇。

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備

小鼠采用與免疫小鼠相同的品系，常用BaLb/c小鼠6～10周齡

↓

拉頸處死 浸泡于75%酒精，消毒3～5分鐘

↓

用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜

↓

用無菌注射器注入6～8ml培養(yǎng)液

↓

反復(fù)沖洗，吸出沖洗液

↓

放入10ml離心管，1200轉(zhuǎn)/分離心5～6分鐘

↓

用20%小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)1×105/ml

↓

加入96孔板，100μl/孔

↓

放入37℃ CO2孵箱培養(yǎng)

一般飼養(yǎng)細(xì)胞在融合前一天制備，一只小鼠可獲得5～8×106腹腔巨噬細(xì)胞，若用小鼠胸腺細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞時，細(xì)胞濃度為5×106/ml，小鼠脾細(xì)胞為1×106/ml，小鼠的成纖維細(xì)胞(3T3)1×105/ml，均為100μl/孔。

(三) 骨髓瘤細(xì)胞

骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細(xì)胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量 McAb。

常用骨髓瘤細(xì)胞系有：NS1、SP2/0、X63 Ag8.653等。

骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)適合于一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10～20%，細(xì)胞的**密度不得超106/ml，一般擴(kuò)大培養(yǎng)以1∶10稀釋傳代，每3～5天傳代一次。細(xì)胞的倍增時間為16～20小時，上述三株骨髓瘤細(xì)胞系均為懸浮或輕微貼壁生長，只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細(xì)胞。

一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞，為確保該細(xì)胞對HAT的敏感性，每3～6月應(yīng)用8～AG(8氮雜鳥嘌呤)篩選一次，以防止細(xì)胞的突變。

保證骨髓瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期，良好的形態(tài)，活細(xì)胞計數(shù)高于95%，也是決定細(xì)胞融合的關(guān)鍵。

(四) 免疫脾細(xì)胞

免疫脾細(xì)胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細(xì)胞棗漿母細(xì)胞。一般取*后一次加強(qiáng)免疫3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液，由于此時B淋巴母細(xì)胞比例較大，融合的成功率較高。

脾細(xì)胞懸液的制備：在無菌條件下取出脾臟，用不*的培養(yǎng)液洗一次，置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸液后計數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的2倍，細(xì)胞數(shù)為2×108左右。液氮罐

二、細(xì)胞融合，選擇雜交瘤

(一) 細(xì)胞融合流程

(1) 取對數(shù)生長的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不*培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不*培養(yǎng)液洗滌2次。

(2) 同時制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不*培養(yǎng)液洗滌2次。

(3) 將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不*培養(yǎng)液洗1次，1200rpm,8分鐘。

(4) 棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。

(5) 輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略加松動。

(6) 在室溫下融合:

① 30秒內(nèi)加入預(yù)熱的1ml45%PEG(Merek,分子量4000)含5%DMSO，邊加邊攪拌。

② 作用90秒鐘，若冬天室溫較低時可延長至120秒鐘。

③ 加預(yù)熱的不*培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔2分鐘分別加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。

(7) 離心，800rpm，6分鐘。

(8) 棄上清，先用6ml左右20%小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細(xì)胞散開。

(9) 根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補(bǔ)加*培養(yǎng)液，10ml一塊96孔板。

(10) 將融合后細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，100μl/孔，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。

一般一塊96孔板含有1×107脾細(xì)胞。

(二) HAT選擇雜交瘤

應(yīng)用HAT 選擇培養(yǎng)液篩選雜交瘤細(xì)胞的原理已在研究生專題講座第六專題中已經(jīng)提到，這里主要介紹加HAT選擇培養(yǎng)的時間和濃度。

一般在融合24小時后，加HAT選擇培養(yǎng)液。HT和HAT均有商品化試劑50×貯存，用時1ml加入50ml20%小牛血清*培養(yǎng)液中。

因為在培養(yǎng)板內(nèi)已加入飼養(yǎng)細(xì)胞、融合后的細(xì)胞，200μl/孔。所以在加選擇培養(yǎng)液時應(yīng)加3倍量的HAT。我們認(rèn)為，融合后*初補(bǔ)加的量可用全量的2/3進(jìn)行選擇，可得到滿意的篩選結(jié)果。

50×HAT

H: 5×10-3M

A: 2×10-5M

T: 8×10-4M

一般選擇HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后，改用HT培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)兩周，改用一般培養(yǎng)液。

三、抗體的檢測

篩選雜交瘤細(xì)胞通過選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細(xì)胞系中，僅少數(shù)能分泌針對免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。

檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。

常用的方法有:

1. ELISA用于可溶性抗原(蛋白質(zhì))、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測。

2. RIA用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測。

3. FACS(熒光激活細(xì)胞分類儀)用于檢查細(xì)胞表面抗原的McAb檢測。

4. IFA用于細(xì)胞和病毒McAb的檢測。

上述方法均為一般實驗室的常規(guī)方法，故在此不介紹具體的實驗過程。

可靠的篩選方法必須在融合前建立，避免由于方法不當(dāng)貽誤整個篩選時機(jī)。

四、雜交瘤的克隆化和凍存

克隆化一般是指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。犚r為經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內(nèi)只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數(shù)個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞;所需要的抗體(特異性抗體)分泌細(xì)胞和其它無關(guān)抗體分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開，就需要克隆化?？寺』脑瓌t是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，因為抗體非分泌細(xì)胞的生長速度比抗體分泌的細(xì)胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果會使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。

(一) 克隆化方案

用克隆化的方法很多，而*常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。

1. 有限稀釋法的程序

① 制備飼養(yǎng)細(xì)胞懸液(同融合前準(zhǔn)備)

② 陽性孔細(xì)胞的計數(shù)，并調(diào)細(xì)胞數(shù)在1～5×103/ml

③ 取130個細(xì)胞放入6.5ml含飼養(yǎng)細(xì)胞*培養(yǎng)液，即20個細(xì)胞/ml，100μl/孔加A、B、C三排為每孔2個細(xì)胞。余下2.9ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.9ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的*培養(yǎng)液,細(xì)胞數(shù)為10個/ml，100μl/孔加D、E、F三排，為每孔1個細(xì)胞。余下2.2ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.2ml 含飼養(yǎng)細(xì)胞的*培養(yǎng)液，細(xì)胞數(shù)5個/ml，100μl/孔，加G、H兩排，為每孔0.5個細(xì)胞。

④ 培養(yǎng)4～5天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細(xì)胞克隆，補(bǔ)加*培養(yǎng)液200μl/孔。

⑤ 第8～9天時，肉眼可見細(xì)胞克隆，及時進(jìn)行抗體檢測。

注:初次克隆化的雜交瘤細(xì)胞需要在*培養(yǎng)液中加HT。

2. 軟瓊脂法

① 軟瓊脂的配制

含20%FCS(小牛血清)的2倍濃縮的RPMI1640

1%瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預(yù)熱。

0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。

② 用上述0.5%瓊脂液(含有飼養(yǎng)細(xì)胞)15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。

③ 按100/ml，500/ml或5000/ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。

④ 1ml 0.5%瓊脂液(42℃預(yù)熱)在室溫中分別與1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合。

⑤ 混勻后立即傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10分鐘，使其凝固，孵育于37℃，5%CO2孵箱中。

⑥ 4～5天后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。

⑦ 檢測抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要時再克隆化。

(二) 雜交瘤細(xì)胞的凍存

及時凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞、每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時候，細(xì)胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細(xì)胞的凍存，則因為上述的意外而全功盡棄。

雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長滿孔底時，一孔就可以凍一支安瓿。

細(xì)胞凍存液:

50%小牛血清

40%不*培養(yǎng)液

10% DMSO(二甲亞砜)

凍存液**預(yù)冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降到0℃，再降溫時一般按每分鐘降溫2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中?；蚣?xì)胞管降至 0℃ 后放-70℃超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可以用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長時間。

五、單克隆抗體的大量生產(chǎn)

大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：

1. 體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為10～60μg/ml，如果大量生產(chǎn)，費用較高。

2. 體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。液氮罐

① 實體瘤法 對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞按1～3×107/ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2 ml, 共2～4點。待腫瘤達(dá)到一定大小后(一般10～20天)則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達(dá)到1-10mg/ml。但采血量有限。

② 腹水的制備 常規(guī)是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液體石臘于BaLb/c鼠，1～2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)5-20mg/ml， 這是目前*常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。

六、單克隆抗體的鑒定

對制備的McAb進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的。應(yīng)對其做如下方面的鑒定:

1. 抗體特異性的鑒定：除用免疫原(抗原)進(jìn)行抗體的檢測外，還應(yīng)用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進(jìn)行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如① 制備抗黑色素瘤細(xì)胞的McAb，除用黑色素瘤細(xì)胞反應(yīng)外，還應(yīng)用其它臟器的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行交叉反應(yīng)，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。② 制備抗重組的細(xì)胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達(dá)菌株的蛋白有交叉反應(yīng)，其次是與其它細(xì)胞因子間有無交叉。

2. McAb的Ig類與亞類的鑒定：一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行篩選時，已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴(kuò)或夾心ELISA來確定McAb的亞類。在作雙擴(kuò)試驗時，如加入適量的PEG(3%)，將有利于沉淀線的形成。

3. McAb中和活性的鑒定：用動物的或細(xì)胞的保護(hù)實驗來確定McAb的生物學(xué)活性。例如如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種于易感的動物或敏感的細(xì)胞，來觀察動物或細(xì)胞是否得到抗體的保護(hù)。

4. McAb識別抗原表位的鑒定：用競爭結(jié)合試驗、測相加指數(shù)的方法，測定McAb所識別抗原位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。

5. McAb親和力的鑒定：用ELISA或RIA競爭結(jié)合試驗來確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親和力。

七、影響因素、失敗原因分析

由于制備McAb的實驗周期長，環(huán)節(jié)多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會造成失敗。

其主要失敗原因和影響因素有:

1. 污染：包括細(xì)菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中*辣手的問題。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應(yīng)及早將污染板棄之，以免污染整個培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來源于牛血清，此外，其它添加劑、實驗室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。在有條件的實驗室，要對每一批小牛血清和長期傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系進(jìn)行支原體的檢查，查出污染源應(yīng)及時采取措施處理。對于污染的雜交瘤細(xì)胞可以采取生物學(xué)的過濾方法，將污染的雜交瘤細(xì)胞注射于BALB/c小鼠的腹腔，待長出腹水或?qū)嶓w瘤時，犖^菌取出分離雜交瘤細(xì)胞，一般可除去支原體污染。液氮罐

2. 融合后雜交瘤不生長：在保證融合技術(shù)沒有問題的前提下主要考慮下列因素①PEG有毒性或作用時間過長。②牛血清的質(zhì)量太差，用前沒有進(jìn)行嚴(yán)格的篩選。③骨髓瘤細(xì)胞污染了支原體。④HAT有問題，主要是A含量過高或HT含量不足。

3. 雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體或停止分泌抗體

① 融合后有細(xì)胞生長，但無抗體產(chǎn)生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生突變，變成A抵抗細(xì)胞所致。

② 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。

③ 對于原分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞變?yōu)殛幮?，可能是?xì)胞支原體污染，或非抗體分泌細(xì)胞克隆競爭性生長，從而抑制了抗體分泌細(xì)胞的生長。也可能發(fā)生染色體丟失。Goding91982)曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗體停止分泌的有效措施。

三要:

要大量保持和補(bǔ)充液氮凍存的細(xì)胞原管。

要應(yīng)用倒置顯微鏡經(jīng)常檢查細(xì)胞的生長狀況。

要定期進(jìn)行再克隆。

三不要:

不要讓細(xì)胞“過度生長”。因為非分泌的雜交瘤細(xì)胞將成為優(yōu)勢，壓倒分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞。

不要讓培養(yǎng)物不加檢查地任其連續(xù)培養(yǎng)幾周或幾個月。

不要不經(jīng)克隆化而使雜交瘤在機(jī)體內(nèi)以腫瘤生長形式連續(xù)傳好幾代。

4. 雜交瘤細(xì)胞難以克隆化 液氮罐

可能與小牛血清質(zhì)量、雜交瘤細(xì)胞的活性狀態(tài)有關(guān)，或由于細(xì)胞有支原體污染，使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆化，應(yīng)在培養(yǎng)液加HT。